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蛋白质印迹法指示剂介绍

蛋白质印记,和萨瑟恩印迹(Southernblot)转移的操作顺序相类似,这里指的是在从聚丙烯酰胺凝胶上往一种合适的固定基质上转移蛋白质。


到目前为止,作为标记的二抗能够通过直接购买结合各种标记物的抗特定IgG的抗体获得。酶连的二抗便是最常用的一种,使用酶连的二抗对印迹进行处理后,再使用底物溶液进行适当的处理。当有颜色的产物由酶纯化底物生成时,就会有可见的区带产生,将所要研究的蛋白质的位置指示出来。辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶一般作为酶连抗体中使用的酶。辣根过氧化物酶能够将H2O2作为底物,使得4-氯萘酚被氧化成蓝色产物或者3-氨基-9-乙基咔唑被氧化成褐色产物。碱性磷酸酶能够使得无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐(BCIP)被转化为蓝色的产物。增强化学发光法为对辣根过氧化物酶进行检测的另外一种方法。在存在H2O2的时候,辣根过氧化物酶使得化学发光物质鲁米诺(luminol,氨基苯二酰一肼)氧化并且发光,如果存在化学增强剂,那么能够将光强度增大1000倍,若想要对辣根过氧化物酶的存在进行检测,可以在照相底片上放置印迹感光即可。


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不仅可以使用酶连二抗作为指示剂,而且其它指示剂也能够使用。分别为如下这些。

1、金标记的二抗:

利用微小的金颗粒对二抗进行包裹,之后和一抗结合时,会有红色被表现出来。


2、生物素结合的二抗:

使用生物素结合的二抗对印迹进行处理后,然后再使用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的凝集素处理。生物素能够和凝集素紧密结合,这种方法事实上与二抗与酶连是通过生物素与凝集素的紧密结合连接的相类似,检测可以利用酶的显色反应。生物素为一个小分子蛋白,一个抗体上既能够和多个酶连接的凝集素相结合,又能够和多个生物素相结合,能够使得显色反应的信号大大地增强。


3、I125标记的二抗:

能够利用放射性自显影进行检测。


4、荧光素异硫氰酸盐标记的二抗:

能够利用在紫外灯下有荧光产生来检测。


5、I125标记金黄色葡萄球菌蛋白A(ProteinA):

ProteinA能够和IgG的Fc区特异性的结合,所用二抗能够使用ProteinA来代替,I125标记的ProteinA利用放射性自显影进行检测。


对于测印迹中的DNA结合蛋白的检测,不但能够使用抗体或蛋白作为检测特定蛋白的探针,而且还能够使用如放射性标记的DNA等其它探针。


2019-08-29 18:02:44 浏览次数:158次

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